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高氧對(duì)肺損傷患兒的影響研究
氧療是提高早產(chǎn)兒存活率的有效方法，但是長時(shí)間高濃度吸氧可導(dǎo)致肺損傷，下面是小編搜集的一篇關(guān)于高氧對(duì)患兒肺損傷影響探究的論文范文，供大家閱讀參考。
近年隨著科技的進(jìn)步，越來越多的極度早產(chǎn)兒和極低出生體質(zhì)量兒幸存下來，但是由于長期吸入高濃度氧，患兒可發(fā)生肺損傷，嚴(yán)重者甚至發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良(BPD)[1,2].目前，高氧性肺損傷的機(jī)制尚不清楚，最近研究的熱點(diǎn)主要集中在氧化應(yīng)激方面[3,4],而NAD+依賴性的組蛋白去乙酰化酶(SIRT1)在氧化應(yīng)激及DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[5].本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過建立高氧損傷人肺泡上皮細(xì)胞(HPAEC)模型[6],探討SIRT1轉(zhuǎn)位是否介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而為減輕高氧肺損傷尋找新的治療靶點(diǎn)。
1材料與方法
1.1細(xì)胞、儀器及試劑HPAEC細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。LX71型倒置相差顯微鏡購自O(shè)lympus公司，F(xiàn)ORMA311型CO2培養(yǎng)箱、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，ANNEXINV流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司，單克隆小鼠抗SIRT1抗體購自博士德生物公司，羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自ZSGB-BIO公司，DAPI購自碧云天生物公司，抗熒光淬滅封片液購自碧云天生物公司，單克隆小鼠抗SENP1抗體與單克隆抗乙酰化p53lys(382)抗體購自Abcam公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。
l.2HPAEC細(xì)胞培養(yǎng)先將HPAEC細(xì)胞復(fù)蘇，加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，放入37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。
1.3HPAEC細(xì)胞分組及高氧干預(yù)取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后傳代接種于培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為高氧組、對(duì)照組。對(duì)照組不作處理，放置于50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);高氧組換液1次后，以3L/min的速度通入含900ml/LO2和50mL/LCO2高純混合氣，通入時(shí)間為10min,參照我們前期高氧模型建立的方法[6].分別培養(yǎng)24h(高氧組細(xì)胞干預(yù)24h后，使用測氧儀檢測培養(yǎng)瓶中氧濃度，如果氧濃度<90%則棄去該標(biāo)本),之后收集HPAEC細(xì)胞。
1.4HPAEC細(xì)胞凋亡情況觀察兩組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測，按照凱基ANNEXINV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。
1.5HPAEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并照相。
1.6HPAEC細(xì)胞SIRT1蛋白轉(zhuǎn)位情況觀察將HPAEC細(xì)胞消化后，按細(xì)胞密度為2×104/孔接種于6孔板中蓋玻片上培養(yǎng)，同步化細(xì)胞，兩組均加入1mL培養(yǎng)基，高氧組另通入高濃度氧，分別培養(yǎng)24h;多聚甲醛固定細(xì)胞10min;0.3%TritonX-100打孔10min;5%封閉血清在37℃封閉30min;將稀釋的抗體SIRT1(終濃度為1∶100)滴加在細(xì)胞爬片上，4℃冰箱孵育過夜，在避光情況下將羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(終濃度為1∶50),37℃濕盒中孵育60min;用PBS洗滌3次，滴加DAPI復(fù)染，免疫共聚焦顯微鏡下觀察并照相;每張細(xì)胞爬片截取5個(gè)視野，每組8張爬片，并照相，計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)位率。
1.7HPAEC細(xì)胞SENP1、乙酰化p53蛋白檢測采用Westernblotting法。兩組細(xì)胞培養(yǎng)干預(yù)24h(細(xì)胞生長80%融合),胰酶消化后PBS沖洗，離心并移去上清。加入200μL裂解混合液，冰浴30min,離心取上清，電泳、轉(zhuǎn)膜，加入一抗，再加入顯色的二抗，以TBST清洗，使用ECL進(jìn)行結(jié)果的顯影，然后用Labworks4.6分析目的條帶的灰度值。
1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
高氧組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為24.77%±2.17%、5.33%±2.60%,兩組比較，P<0.05.高氧組細(xì)胞從正常的長梭形、多角形變成圓形、橢圓形，細(xì)胞間的間隙增寬，懸浮的細(xì)胞較多;對(duì)照組細(xì)胞大多為長梭形、多角形，貼壁較好，細(xì)胞間的間隙較小，懸浮的細(xì)胞較少。高氧組和對(duì)照組細(xì)胞SIRT1蛋白轉(zhuǎn)位率分別為88.89%(96/108)、16.23%(25/154),兩組比較，P<0.05.高氧組和對(duì)照組細(xì)胞SENP1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.76±0.12、0.67±0.02,乙酰化p53蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.81±0.07、0.52±0.03,兩組比較，P均<0.05.
3討論
近年來，早產(chǎn)兒的出生率逐年增高，早產(chǎn)兒中大部分會(huì)發(fā)生夭折，氧療是提高早產(chǎn)兒存活率的有效方法，但是長時(shí)間高濃度吸氧可導(dǎo)致肺損傷，從而導(dǎo)致BPD的發(fā)生[7].活性氧簇(ROS)增多所致的氧化應(yīng)激損傷是早產(chǎn)兒高氧肺損傷發(fā)生的主要機(jī)制[8],而SIRT1蛋白能顯著降低ROS水平和促進(jìn)細(xì)胞生存[9].
SIRT1蛋白是一種NAD+依賴性脫乙酰酶，作為哺乳動(dòng)物生命周期相關(guān)蛋白，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和調(diào)控生命周期。SIRT1蛋白主要定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞能量代謝、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期控制、抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化逆境和延長細(xì)胞壽命方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，是機(jī)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白[10,11].Yang等[12]用紫外線輻射、過氧化氫誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，SIRT1蛋白可發(fā)生翻譯后修飾，在734位賴氨酸上發(fā)生小泛素樣修飾蛋白(SUMO)修飾。該修飾決定著SIRT1蛋白在細(xì)胞核的定位。這是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、可逆的過程，其去SUMO修飾的過程則由SENP1介導(dǎo)[13,14].SIRT1蛋白主要存在于細(xì)胞核，少量存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)SIRT1蛋白能被SENP1去SUMO化，使p53蛋白的第382位賴氨酸殘基去乙酰化減少，抑制p53與靶DNA順式原件結(jié)合，進(jìn)而抑制p53促凋亡活性[15~18].本研究顯示，高氧組細(xì)胞生長較差，細(xì)胞間隙增寬，懸浮細(xì)胞較多，細(xì)胞的凋亡率增加，這與我們的前期實(shí)驗(yàn)[6]結(jié)果一致，即高氧可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究還顯示，高氧組SENP1蛋白表達(dá)、SIRT1轉(zhuǎn)位率、乙酰化p53表達(dá)均較對(duì)照組升高，這與Yang等[12]結(jié)果一致。提示高氧可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其凋亡的機(jī)制與SIRT1蛋白相關(guān)。
總之，高氧誘導(dǎo)SENP1蛋白表達(dá)，促使SIRT1蛋白發(fā)生去SUMO化，發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)位，去乙酰化活性減低，對(duì)p53去乙酰化活性減低，乙酰化p53相對(duì)增加，從而激活下游的凋亡通路而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
參考文獻(xiàn)：
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